产品介绍 染料法支原体污染实时定量pcr试剂盒 dye-quantitative real-time pcr kit for mycoplasma contamination
货号：myco-qs-20，规格：20个反应 货号：myco-qs-20，规格：20个反应 货号：myco-qs-20，规格：20个反应
试剂盒特点： 1， 本试剂盒对柔膜菌纲（包括支原体、螺原体和无胆甾原体）有极强的特异性，与柔膜菌纲以外的其他基因组无交叉反应。 2， 本试剂盒灵敏度高，最低可检出反应液中2-4个基因组。 3， 本试剂盒使用热启动的taq酶，可抑制非特异性扩增，降低背景荧光。 4， 本试剂盒带有阳性对照样品（组分c），可用于检验试剂盒有效性，也可用于验证待测样品中是否含有pcr抑制剂。 5， 本试剂盒带有rox参比染料，帮助校正加样误差和管间差异。
支原体(mycoplasma)属于柔膜菌（mollicutes）纲,直径约0.1-0.3 μm,具有变形能力，因此可以轻易穿过常规的0.22 μm无菌滤膜,是常见的动物细胞培养污染源。由于支原体体积太小，在光学显微镜下不可分辨，因此细胞常常在不知不觉中被污染。 目前的经典检测方法是欧洲药典（european pharmacopeia）2.6.7规定的体外培养法，用特殊培养基对支原体进行培养，以此检测污染情况。培养法的优点是检测灵敏度高，缺点是耗时较长，最长的需要28天之久，而且受操作人员的技能水平影响较大，不同实验室的检测误差较大。随着生物制药业的发展，很多生物制品保质期较短，因此需要一种快速、灵敏并且特异性强的支原体检测方法。欧洲药典因此接纳了核酸检测方法作为培养法的替代方案。定量pcr法可以在几个小时内完成检测，灵敏度与培养法相当，甚至更好。 本试剂盒以16s rrna基因为靶点，设计了多对引物，可检出大部分已知的支原体，以及部分螺原体和无胆甾原体，与亲缘关系较近的革兰氏阳性菌，如链球菌、梭菌、乳杆菌等，没有交叉反应，在检测范围和特异性方面达到欧洲药典的要求。欧洲药典提及的所有支原体均在本试剂盒的检测范围内。灵敏度方面，最低检测值可以达到每个反应2-4个基因组，在不考虑dna提取损耗的情况下，达到欧洲药典要求的10 cfu/ml的最低检测值。 本试剂盒包含热启动taq酶、dntp（以utp代替了ttp）、引物、阳性对照品、sybr green i染料、rox染料，和用以防止残余dna污染的udg（尿嘧啶-n-糖苷酶），用户只需准备好dna样品即可使用。
注意事项： 1， 本产品仅限于科研使用，不作诊断用途。 2， 操作过程中应注意防范样品之间的串联污染。**对工作区域进行划分，将不同步骤，如dna提取和pcr反应液的配制，分开在不同阶段不同区域进行。使用无污染的一次性枪头，**是带滤芯的枪头。**在通风区域操作，操作时须佩戴无粉尘手套。 3， 对于在584 nm附近可产生激发光的仪器（大部分使用钨灯或卤素灯作为光源的仪器，还有一些仪器专门配置了led灯，可激发~584 nm光源），rox的反应浓度为30-50 nm。对于不能在584 nm附近可产生激发光的仪器（大部分以激光为光源的仪器），rox的反应浓度为300-500 nm。具体可参考仪器的使用手册。 热启动taq酶结合了特异性单克隆抗体的dna聚合酶，在室温下聚合酶活性被抗体抑制。在pcr循环的变性阶段，抗体受热被去除，聚合酶活性恢复，因此获得“热启动”功能，可减少残余dna的污染，提高pcr扩增效率、灵敏度和目的片段产量。 sybr green i可以与dna双链的小沟结合，结合后在497nm激发光照射下产生520nm的发射光。未结合双链dna的sybr green i基本不产生荧光。因此可以根据荧光值的大小判断溶液内dna双链的多寡，用于实时检测pcr反应过程中产物的累积量。初始模板浓度越高，反应循环数越高，则双链dna含量越高，荧光值也就越高。值得注意的是，sybr green i也可以结合非特异性pcr产物以及引物二聚体，此时产生的荧光与目标扩增产物无法区分。为了判断荧光信号是否来自目标扩增产物，可以绘制熔解曲线。通过逐步缓慢升温，使双链dna解离为单链dna，同时检测荧光值的变化，绘制曲线，根据荧光值观察dna解链的温度。 udg和dutp可以阻止前次步骤残余dna的扩增。dutp可以确保扩增后的dna中均含有尿嘧啶。udg可从单链或双链dna上去除尿嘧啶残基，从而阻止含有尿嘧啶的dna作为下几轮pcr的模板。在pcr循环开始前的udg孵育步骤，可以破坏带有尿嘧啶的pcr产物。经过该去除污染步骤后，udg在正常的pcr循环过程中被高温灭活，对pcr反应没有影响。 rox不参与pcr反应，在pcr反应过程中荧光没有变化，可以提供一条基线用于校正加样误差和管间差异，便于仪器自动分析报告荧光与内参rox荧光的比值，使定量更准确。rox染料的激发波长为584nm，发射波长为612nm。用rox进行校正后可以使实验误差减小十倍左右。
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