产品介绍 cck-8试剂盒 cell counting kit -8
检测原理 cck-8试剂盒是一种基于wst-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 wst-8属于mtt的升级产品，能在电子载体1-甲氧基pms的作用下被还原成水溶性甲臜产物，生成的甲臜量与活细胞数量成正比，因此颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定od值，可以反映活细胞数量。
cck-8法与普通的mtt法相比，具有显著特点： ★灵敏度高，数据可靠，重现性好 ★操作简便，省时省力 ★水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞 ★无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低 ★为1瓶溶液，毋需预制，即开即用 ★适合于高通量药物筛选 cck-8用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
cck-8方法的优势 cck-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
保存条件： 4oc避光保存一年有效， -20oc避光保存两年有效。 避免反复冻融。
cck-8试剂盒操作说明 cck-8溶液可直接加到细胞中，不需要与其它组分预混。由于cck-8溶液非常稳定并且细胞毒性很小，所以可以进行长时间孵育，例如孵育24-48小时。 在进行以下实验之前，可先设置空白对照孔，仅加入相应量细胞培养液、药物和cck-8溶液，不加入细胞。 方法一. 制作标准曲线（测定细胞具体数量） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。 2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后按培养基体积的10%加入cck-8试剂，培养一定时间后测定od值，制作出一条以细胞数量为横坐标（x轴），od值为纵坐标（y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入cck-8后的培养时间。） 方法二. 细胞活性检测 1、在96孔板中接种细胞悬液（100 μl/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% co2）。 2、向每孔加入10 μl cck-8溶液。 3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 方法三. 细胞增殖-毒性检测 1、在96孔板中加入90 μl的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% co2）。 2、向培养板加入10 μl不同浓度的待测物质。 3、将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4、向每孔加入10 μl cck-8溶液。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
活力计算： 细胞活力(%)=[a(加药)-a(空白)]/[a(不加药)-a(空白)] ×100 a(加药)：具有细胞、cck 溶液和药物溶液的孔的吸光度 a(空白)：具有培养基和cck 溶液而没有细胞的孔的吸光度 a(0 加药)：具有细胞、cck 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
注意事项: 1，由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的pbs、 水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。 2，本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应， 所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加cck-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。培养基中酚红和血清的吸光度，在计算时通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 3，有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入cck-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰od值读数。加完之后最好能够离心，以免cck-8液滴悬挂在壁上。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。 4，若暂时不测定od值，可以向每孔中加入10 μl 0.1m的hcl溶液或者1% w/v sds溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 5，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入cck-8试剂后的培养时间。白细胞可能需要培养较长时间。若使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入cck-8溶液。 6，若没有450nm的滤光片，可使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。 7，金属对cck-8显色有影响。终浓度为1 mm的氯化亚铅、氯化铁、cuso4会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mm的话，将会100%抑制。 8，本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 |
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