琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素-pg电子游戏网站

琼脂糖凝胶电泳迁移速率的影响因素：

1、 dna的分子大小及构型

不同构型dna的移动速度次序为：共价闭环dna(covalently closed circular，cccdna)>直线dna>开环的双链环状dna。线状双链dna分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与dna分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。当琼脂糖浓度太高时，环状dna(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为0(rm=0)，而同等大小的直线双链dna(刚性棒状)则可以长轴方向前进(rm>0)，由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度。

2、琼脂糖浓度

一个给定大小的线状dna分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。dna电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于dna分子的大小。分离小于0.5kb的dna段所需胶浓度是 1.2-1.5%，分离大于10kb的dna分子所需胶浓度为0.3-0.7%，dna段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、 dna分子的构象

当dna分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋dna在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋dna移动快，而线状双链dna移动慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条dna带难以确定是质粒dna不同构象引起还是因为含有其他dna引起时，可从琼脂糖凝胶上将dna带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的dna图谱，则为同一种 dna。

4、电源电压

琼脂糖凝胶分离大分子dna实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性dna分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，不同分子量的dna段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的dna段的分辨率达到较大，电场强度不宜高于5v/cm。

5、嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的dna，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状dna，使其刚性更强，还会使线状dna迁移率降低15%。

6、离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响dna的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率*小，几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或dna变性。对于天然的双链dna，常用的几种电泳缓冲液有tae[含edta (ph8.0)和tris-乙酸]，tbe(tris-硼酸和edta)，tpe(tris-磷酸和edta)，一般配制成浓缩母液，储于室温。