rab5活性检测试剂盒-pg电子游戏网站

rab5 pull-down activation assay kit

cat. # 83701

introduction

蛋白a/g琼脂糖拉下。最后用anti-rab5 rabbit polyclonal antibody免疫印迹法检测沉淀的rab5-gtp。

c.试剂盒组件

1. 抗rab5 - gtp小鼠单克隆抗体(cat。# 26911): 1瓶- 35 μl (1 mg/ml) pbs, ph 7.4，含50%甘油。该抗体特异性识别来自所有脊椎动物的rab5-gtp。

2. 蛋白质a/g琼脂糖(猫。# 30301):一个小瓶- 600 μl 50%的浆液。

3.5x分析/裂解缓冲液(cat。# 30302):一瓶- 30 ml 250 mm tris-hcl, ph 8, 750 mm nacl, 50 mm mgcl2, 5 mm edta, 5% triton x-100。

4. 抗rab5兔多克隆抗体(cat。# 21151): 1瓶- 50 μl (1 mg/ml) pbs, ph值7.4，含有50%甘油。

5. 100x gtpγs (cat。# 30303): 1瓶- 50 μl 10 mm，使用5 μl gtpγs对0.5 ml细胞裂解液进行gtp标记。

6. 100倍gdp (cat。# 30304):一个小瓶- 50 μl在100 mm，使用5 μl gdp用于gdp标记0.5 ml细胞裂解液。

7. hrp -山羊抗兔igg(猫。#29002): 50 μl (0.4 mg/ml) pbs, ph值7.4，含50%甘油。

d.需要但未提供的材料

1. 刺激和非刺激细胞裂解物

2. 蛋白酶抑制剂

3.4°c管摇杆或激振器

4. 0.5 m edta, ph 8.0

5. 1.0 m mgcl2

6. 减少2倍的sds-page样品缓冲液

7. 电泳和免疫印迹系统

8. 免疫印迹洗涤缓冲液，如tbst (10 mm tris-hcl, ph 7.4, 0.15 m nacl, 0.05% tween-20)

9. 免疫印迹阻断缓冲液(含5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白的tbst)

10. ecl检测试剂

e.示例结果

下图演示使用rab5活化测定试剂盒所看到的示例结果。仅供参考。

rab5激活实验。用gdp(左道)或gtpγs(右道)处理纯化的全长rab5蛋白后进行免疫共沉淀。用抗rab5 - gtp单克隆抗体(cat。# 26911)。免疫印迹法检测抗rab5多克隆抗体(cat。#。21151)。

试验过程

a.试剂制备

1x测定/裂解缓冲液:混合5x原液(cat。# 30301)并在去离子水中稀释至1x。在使用前添加蛋白酶抑制剂，如1 mm pmsf、10 μg/ml白细胞肽素或10 μg/ml抑肽酶。

b.样品制备

贴壁细胞

1. 培养细胞(一个10厘米的平板，约107个细胞)，约80-90%融合。根据需要用激活剂或抑制剂刺激细胞。

2. 抽吸培养基，用冰冷的pbs冲洗两次。

3.完全去除最终pbs洗涤液，并将冰冷的1x测定/溶解缓冲液(参见试剂制备)添加到细胞中(每10 cm组织培养板0.5-1 ml)。

4. 将培养板放在冰上10-20分钟。

5. 用刮板将电池从板上刮下来。

6. 将裂解物转移到合适大小的试管中并置于冰上。

7. 如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液。如果发生这种情况，则可将裂解物通过27½号注射器针头3-4次，以剪切基因组dna。

8. 通过在12,000 x g和4℃离心10分钟来清除裂解产物。

9. 收集上清液并将样品(~1-2 mg总蛋白)储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存在-70℃以备日后使用。

贴壁细胞

1. 培养细胞并根据需要用激活剂或抑制剂进行刺激。

2. 进行细胞计数，然后通过离心将细胞制成颗粒。

3.抽吸培养基，用冰冷的pbs冲洗两次。

4. 完全去除最终pbs洗涤并将冰冷的1x测定/溶解缓冲液(参见试剂制备)添加到细胞颗粒(0.5-1 ml / 107个细胞)。

5. 通过反复移液溶解细胞。

6. 将裂解物转移到合适大小的试管中，并将其置于冰上。

7. 如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液。如果发生这种情况，则可将裂解物通过27½号注射器针头3-4次，以剪切基因组dna。

8. 通过在12,000 x g和4℃离心10分钟来清除裂解产物。

9. 收集上清液并将样品储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存在-70°c以备日后使用。

c. gtpγs/gdp蛋白体外阳性和阴性对照

注:体内刺激细胞将激活约10%的rab5，而体外负载gtpγs蛋白将激活近90%的rab5。

1. 将0.5 ml细胞提取液(或1 μg纯化的rab5蛋白)分入两个微离心管中。

2. 每管加入20 μl 0.5 m edta(终浓度20 mm)。

3.阳性对照:加入5 μl 100 x gtpγs (cat;# 30302)到**管

4. 阴性对照:加入5 μl 100 × gdp (cat。# 30304)连接到**管。

5. 在搅拌的情况下，在30℃孵育两管30分钟。

6. 通过将管置于冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2(最终浓度为60 mm)来停止加载。

d.活化g蛋白的亲和力沉淀

1. 将0.5-1 ml细胞裂解物(约1 mg总细胞蛋白)分拆至微离心管中。

2. 用1x测定/溶解缓冲液将体积调整为1 ml(参见试剂制备)。

3.加入1 μl抗rab5 - gtp抗体(cat。# 26911)。

4. 制备蛋白a/g琼脂糖珠浆(cat。# 30301)通过顶点或滴定重悬。

5. 快速加入20 μl重悬珠浆至上述管中。

6. 在4℃下将管缓慢搅拌1小时。

7. 通过5,000 x g离心1 min使珠粒成球。

8. 抽吸并丢弃上清液(确保不要干扰或移除珠粒)。

9. 用0.5 ml 1x测定/裂解缓冲液洗涤3次，每次离心并抽吸。

10. 在第三次洗涤后，通过离心使珠粒成球并小心地去除所有上清液。

11. 在20 μl 2x还原sds- page样品缓冲液中重悬小球。

12. 将样品煮沸5分钟。

13. centrifuge it at 5,000 x g for 10 seconds.

e. western blot分析

1. 将15 μl/孔下拉上清液装入聚丙烯酰胺凝胶(17%)中。建议包括预染色mw标准(作为以下步骤3中成功转移的指标)。

2. 按照制造商的说明进行sds-page。

3.按照制造商的说明将凝胶蛋白转移到pvdf或硝酸纤维素膜上。

注:步骤4-11在室温下搅拌

4. 电印迹后，将pvdf膜浸入100%甲醇中15秒，然后在室温下干燥5分钟。

注:如果使用硝酸纤维素代替pvdf，应跳过步骤4。

5. 在室温下用5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白在tbst中封闭膜1小时，并持续搅拌。

6. 用tbst清洗3次，每次5分钟。

7. 用抗rab5兔多克隆抗体(cat。# 21151)，用5%脱脂干牛奶或3% bsa在tbst中以1:50 ~500(取决于样品中rab5蛋白的量)新鲜稀释，在室温下持续搅拌1-2小时或在4℃过夜。

8. 用tbst清洗3次，每次5分钟。

9. 用二抗(cat。# 29002)，用5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白(bsa)在tbst中以1:1000的比例新鲜稀释，在室温下恒定搅拌1小时。

10. 用tbst清洗3次，每次5分钟。

11. 使用您选择的检测方法，如ecl